细胞免疫荧光染色操作步骤

细胞免疫荧光染色操作步骤
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细胞免疫荧光染色操作步骤

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合,其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光。实验步骤如下:

1. 已转染72h 的细胞种于共聚焦专用培养皿里,冰PBS 洗三遍,每次5分钟。

2. 细胞半干时,覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟,避光。

3. 吸去多聚甲醛后,用冰PBS 洗三遍,每次5分钟。

4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟,冰PBS 洗三遍,每次5分钟。

5. 与二抗相同宿主的血清?进口胎牛血清室温封闭30分钟。

6. 配制一抗(SAB2104246-50UG, Sigma, USA):SAB+FBS=1:200。

7. 加入一抗覆盖细胞,锡纸包裹4度避光过夜。

次日:

8. 取出细胞复温至室温约1h 。

9. 冰1‰Tween洗两次,每次5分钟,于摇床。冰PBS 洗一次,5分钟,于摇床。

10. 配制荧光标记二抗:Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC,用PBS 或FBS 配制。浓度1:200

11. 加入二抗,室温孵育1小时(避光) 。

12. 冰1‰Tween洗两次,每次5分钟,于摇床。冰PBS 洗一次,5分钟,于摇床。

13.DAPI 染核,每皿1滴,完全覆盖住细胞即可。

14. 冰1‰Tween洗两次,每次5分钟,于摇床。冰PBS 洗一次,5分钟,于摇床。

15. 加入防荧光淬灭封片剂,避光。

16. 上机confocol

建议:1. 还是染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会淬灭的。2. 荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。3. 二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。4. 不管采用何种方法,在使用PBS 缓冲液漂洗时,如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。

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